Главная Для отопления

Сложные методы окрашивания микроорганизмов. Методы окраски микробиологических препаратов. Витальные методы окраски

Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) - катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители - эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители - генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них - водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим - 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

При простых методах окраски используется лишь одна краска.

С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксин или метиленовая синька. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.

При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.

Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

Депарафинированные срезы доводят до воды.
Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
Промокают фильтровальной бумагой.
Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
Проводят через 3 смены ксилола.
Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

Окраска бактерий по по Цилю-Нильсену

Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.

Методика окраски:

1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров.	Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава.
2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают.
3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты.	Серная кислота-обесцвечивающий фактор.
4. Промывают водой
5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут	Синька Леффлера - дополнительная краска
6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией	Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора - синего цвета

Окраска по по Ауески

Метод окраски спор бактерий, заключающийся в обработке препарата горячим 0,5% раствором соляной кислоты с последующей фиксацией и окраской по способу Циля - Нельсена; споры окрашиваются в рубиново-красный цвет, вегетативные формы - в синий.

При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спирто-водного или водного раствора краски на 1-2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин (1:10) или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно фуксином (1:10) красят 10-30 секунд, а метиленовой синькой – 2-10 минут. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно, а при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще, продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.

Окраска по Муромцеву

Готовят два раствора:

После растворения краски оба раствора смешивают и профильтровывают через бумажный фильтр. Краска сохраняется долгое время. Мазки красят через полоски фильтровальной бумаги в течение 15 – 30 секунд.

При данной окраске мазков в микробных клетках выявляются включения, биполярность, капсулы и споры. Метод удобен для окраски мазков из органов, крови, культур на средах с нативным белком и на полужидком агаре.

Фон препарата из указанных субстратов розовый; клетки ткани и микробные тела окрашиваются в голубовато-синие цвета.

Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков

Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является главной (основной) краской, а другое – дополнительной (контрастной). После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Промывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполным. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото- и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивыми. Наконец, некоторые, например, споры, энергично противостоят воздействию всех обесцвечивающих веществ и относятся к группе краскоустойчивыx.

Сложные методы окраски имеют важное дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба.

Окраска по Граму

При обработке мазков (срезов) из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни из содержащихся в мазке бактерий также обесцвечиваются, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, фуксином Пфейффера) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом (нагреванием). Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов.

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1-2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30-60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2-3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).

Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: возможен механический перенос микробов с одного мазка на другой, что может отразиться на результатах микроскопии. Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя (протравой) и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы (в том числе и rpaмположительные) обесцветятся. На густой, толстый мазок (например, из агаровой культуры) время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. При воздействии спиртом на неравномерно приготовленный мазок в толстых его частях микробы остался необесцвеченными, а в тонких обесцветятся; получится «пестрая» картина окраски, что может привести к неправильным выводам.

Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах (несколько часов роста) из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2-3 раза крупнее взрослых особей (18-часовых), очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек.

Для начинающих, а также в сомнительных случаях, рекомендуется на том же стекле, где находится исследуемый мазок, приготовить по сторонам контрольные препараты - один из культуры микробов, заведомо грамположительных, а другой - из грамотрицательных.

При обесцвечивании препарата в окраске по Граму спирт можно наливать непосредственно на мазок, постоянно покачивая стекло. Лучше же обесцвечивание проводить в кюветках, куда наливают спирт и, захватив пинцетом Корнэ препарат, поднимают и опускают его, следя за цветом стекающего со стекла спирта. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10-30 секунд, в зависимости от толщины мазка.

Спирт 96° в кюветках следует чаще сменять (80° спирт уже неправильно дифференцирует мазок). Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки.

Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. По данным Саватеева, достаточно добавить 2-4 мл 10% йодной настойки на 100 мл 95° спирта; раствор может сохраняться долгое время. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием.

Для обесцвечивания мазков йодированным спиртом достаточно двух минут, после чего следует промывка водой и дополнительная окраска фуксином Пфейффера.

Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли. Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии.

Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.

Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты ее снимают, а краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.

При окраске по методу Грама в модификации Синева на первом этапе используют фильтровальные бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают. На фиксированный мазок помещают пропитанную красителем бумажку, заливают небольшим количеством воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают краску и, не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят общепринятым методом.

Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:

1. Грамположительные бактерии:

— кокки (за исключением гонококков и менингококков);

— бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);

— микобактерии, коринебактерии и листерии.

2. Грамотрицательные бактерии:

— некоторые кокки (гонококки и менингококки);

— все остальные палочковидные бактерии;

— все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Структура бактериальной клетки

Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:

— основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);

— временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).

Основные структуры.

Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной оболочки. Функции клеточной стенки:

— защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;

— определение формы бактерий;

— участие в метаболизме бактерий;

— токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);

— наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).

В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный линейный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.

Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма ) представлен пептидогликаном в виде тонкой непрерывной сетки. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана ) состоит из липополисахарида , белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами . У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.

В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты — это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий — это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) — это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое ко-личество углеводов.

ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:

— барьерная функция (молекулярное “сито”);

— избирательный перенос раз-личных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;

— превращение клеточ-ной энергии;

— репликация и последующее разделение хро-мосомы.

В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом . По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.

Цитоплазма — это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.

Цитозоль — гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.

Структурные элементы — это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.

Рибосомы — органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.

В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включе-ния, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество — гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, назы-ваемых волютиновыми , или метахроматиновыми , зернами.

Нуклеоид является аналогом ядра у прокариот. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.

Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды , которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).

К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.

Капсула — это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.

Функции капсулы:

— место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;

— защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;

— способность прикрепления клеток к субстрату.

Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:

— монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;

— амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;

— лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;

— перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином .

К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили . Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.

У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях — эндоспо-ры . Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.

Расположение спор в клетке:

— центральное (возбудитель сибирской язвы);

— субтерминальное — ближе к концу (возбудитель ботулизма);

— терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).

Витальный способ окраски

Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры.

Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.

Поствитальные способы окраски

Способы окраски фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и сложные . При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.
Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.
Из сложных способов окрашивания бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю - Нельсену, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского - Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу - Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю - Нельсону и др.

Для окраски простейших применяют способ Романовского - Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.
Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля - Нельсона, Леффлера, Романовского - Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.

См. также

Литература

Барыкина Р.
П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с. - 2000 экз. - ISBN 5-211-06103-9. - УДК 58:57.08

Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю - Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение.

Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые).

Если красящий ион (хромофор) - катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор — анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители - эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители - генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них - водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток.

Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим - 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе.

Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

Механизм и этапы окраски по Граму

На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.

2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод)

Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой

5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

* Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный.

Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону

На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин

2. Снять бумагу, провыть мазок водой

3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой

5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3-5 мин

Промыть водой, высушить и микроскопировать

* Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окр. метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые остаются окрашенными фуксином в красный.

Возбудитель чумы

Возбудитель – Yersinia pestis.

грамотрицательные палочки, овоидной формы, окрашиваются биполярно.

Подвижны, имеют капсулу, спор не образуют Факультативные анаэробы. Хорошо культивируются на простых питательных средах. Ферментируют большинство углеводов без образования газа. Два типа колоний — молодые и зрелые. Молодые с неровными краями. Зрелые колонии крупные, с бурым зернистым центром и неровными краями.

Биохимические свойства: фенментативная активнсть высокая: ферментация до кислоты ксилозу, синтез плазмокоагулазы, фибринолизина, гемолизина, лецитиназу, сероводород.

чувствителен к антибиотикам нестоек к окружающей среде при высокой температуре.

Клинические особенности: Инкубационный период – несколько часов до 8 сут. Различают локальные – кожно-бубонная, бубонная; внешне-диссеминированные – первично-легочная, вторично-легочная и кишечная; генерализованная – первично-септическая, вторично-септическая формы чумы. Региональная лимфоаденопатия, энтероколиты, реактивные артриты, спондилит, лихорадка.

Эпидемиология: Чума — классический природноочаговый зооноз диких животных.

Основные носители в природе — сурки, суслики, в городских условиях — крысы. В передаче возбудителя — блохи животных, способные заражать человека.

Иммунитет: клеточно-гуморальный, ограничен по длительности

Микробиологическая диагностика:

Бактериоскопическое исследование.

Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму и водным раствором метиленового синего. Бактерии чумы представляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром. На бульоне бактерии образуют пленку; ферментируют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают.

Биопроба. Проводится для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой.

Экспресс-методы лабораторной диагностики:

2.РПГА — для обнаружения антигенов бактерий в материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроциты.

Лечение: антибиотики Профилактика: специфическая профилактика — живая ослабленная чумная вакцина EV.

Чумной бактериофаг – при идентификации Y.pestis.

Чумная сухая вакцина – высушенная живая культура Y.pestis вакцинного штамма EV, используется для профилактики чумы.

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) - сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных - от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий - периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами - β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом - антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У присутствует дополнительная структура - внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют - предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий - с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными - окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.

Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.

Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.

Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену

Метод Грама. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при дифференциации спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.

Таблица 4. Метод Грама

Этапы окраски	Цвет бактерий
1. На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты	Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет
2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту	Все бактерии остаются фиолетовыми
3. Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт и обесцветить в течение 30-60 с, промыть водой	Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются
4. Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) и докрасить 1-2 мин, промыть водой, высушить	Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет

Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.

Таблица 5. Метод Циля-Нильсена

Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовых кислот, восков, глико- и фосфолипидов), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем – метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.leprae, M.tuberculosis, M,bovis и др.)

III. План практической работы

1. Изучить механизм и этапы окраски по Граму, приготовить мазок из смеси бактерий и окрасить по Граму, заполнить таблицу в рабочей тетради.

2. Изучить механизм и этапы окраски по Цилю-Нильсену, приготовить мазок из сапрофитных микобактерий, окрасить по Цилю-Нильсену, заполнить таблицу в рабочей тетради.

3. Сравнить строение прокариотической и эукариотической клетки по ряду признаков, заполнить таблицу в рабочей тетради.

4. Изучить и перечислить в таблице основные таксономические категории на примере C.tetani и T.pallidum или других бактерий.